lunes, 14 de marzo de 2016

¿Existe el VIH? (III): Retrotranscriptasa vs. hTERT

Partículas de VIH marcadas con oro. Los puntos pequeños son moléculas de
GAG marcadas. Fuente: https://depts.washington.edu/jaisril/microscopy/
Hace dos semanas empezamos con esta serie que intenta dilucidar si tenemos o no evidencias de que el VIH existe o es una conspiración mundial para... para... bueno, para algo. Hasta ahora, en las dos primeras ediciones, hemos hecho una pequeña introducción al problema del negacionismo, con un bosquejo histórico del negacionismo y del principal grupo negacionista y una recopilación de evidencias físicas que hemos analizado por medio de herramientas bioinformáticas.

Hoy vamos a abordar un punto que se convierte en controversia por desconocimiento. Hay quien considera que una subunidad de la telomerasa, que es capaz de usar ARN como molde, es una retrotranscriptasa equivalente a la del virus. Vamos a demostrar por qué no es así y a señalar cuáles son las diferencias entre una y otra para dejar claro por qué no se pueden confundir entre sí.


Retrotranscriptasa

La retrotranscriptasa (RT) o transcriptasa reversa o transcriptasa inversa si preferís es una enzima específica de retrovirus. Su función está clara: originar un ADNc (o ADN copia) a partir de una única hebra de ARN. Las primeras retrotranscriptasas descritas fueron la del virus del sarcoma de Rous y la del virus de la leucemia murina en 1970. Los responsables de estos hallazgos fueron Howard Temin y David Baltimore, respectivamente. Ambos recibieron el Nobel de Medicina en 1975, junto a Renato Dulbecco por este descubrimiento.
Subunidad catalítica de la retrotranscriptasa del VIH-1. A la derecha, se muestra la estructura secundaria de la proteína y su
plegamiento. A la izquierda, la superficie que genera dicha estructura. Será importante más adelante.
Esta enzima posee dos subunidades. Una subunidad catalítica, que es la que aparece en la imagen anterior, y una subunidad nucleasa. La RT se va a unir al ARN que compone el genoma del VIH y va a copiar este ARN en un ADNc que será capaz de integrarse en el genoma del hospedador para copiarse cada vez que se copie el ADN de la célula en la que se aloja.

En el caso del VIH, el genoma posee dos secuencias que son complementarias en los extremos 5' y 3'. En estas dos secuencias se unirá una molécula de ARNt celular, que va a actuar como cebador. El cebador o primer es una molécula que sirve como "entradilla" para que una enzima que copia ADN comience a copiar. Este cebador de ARNt celular va a servir para que la RT entre en el extremo 5' del ARN vírico. Además, esta misma molécula de ARNt va a servir como cebador en la copia del ARN vírico hacia ADN.

Retrotranscripción paso a paso

Paso 1: Un ARNt de la célula hospedadora se une a la secuencia de unión de cebador (PBS) del ARN del VIH.

Paso 2: Una vez se une el ARNt a la región PBS, se une al complejo la RT.

Paso 3: La enzima una vez unida va a copiar las secuencias que quedan hacia el extremo 5' del genoma del virus.

Paso 4: Una vez copiadas, la RT, con su actividad exonucleasa, va a degradar las secuencias hacia el extremo 5' del genoma del VIH, conservando las recién copiadas.

Paso 5: Estas secuencias recién copiadas saltarán ahora al extremo 3' del genoma del VIH.

Paso 6: La RT, utilizando las secuencias del paso 4 como cebador, copia el ARN del VIH en formato ADN.

Paso 7: Una vez ha copiado el ARN en forma de ADN, la RT elimina el ARN del virus, exceptuando una secuencia llamada PP.

Paso 8: Partiendo de PP, la RT copia la parte que queda hacia el extremo 3' de esta secuencia PP.

Paso 9: Una vez se obtiene sólo secuencia de ADN, el ARNt que actuó de primer desde el paso 1 sale del complejo. La RT elimina la secuencia PP, el último fragmento del ARN original del virus.

Paso 10: La salida del ARNt deja dos secuencias PBS libres y complementarias, que se unirán entre sí.

Paso 11: La RT copia lo que falta, obteniéndose ahora un ADN bicatenario que podrá integrarse dentro del genoma de la célula hospedadora. Una vez allí, cada vez que la célula hospedadora se divida hará una copia del genoma del virus y cada célula hija se llevará una. En ciertos virus que carecen de la actividad polimerasa, es posible que la ADN-polimerasa-δ sea quien sustituya esta actividad polimerasa elongando la cadena de ADN bicatenario final.

Recordemos aquí que el VIH infecta a un tipo celular del sistema inmunitario, las células Th. Estas células son una de las líneas celulares que más se divide en el organismo, de forma que la expansión del virus puede ser muy rápida en muy poco tiempo.

Transcriptasa inversa de la telomerasa humana


Es como se conoce a la enzima cuya abreviatura es hTERT. Compone la parte más importante de la subunidad catalítica de la telomerasa, que se completa con un ARN no codificante (ARNnc). ¿Qué es lo que hace esta proteína? Pues para explicarlo vamos a tener que ir muy despacito. A ver si me vais siguiendo.

Como sabéis, las células humanas poseen 23 pares de cromosomas. Cada uno de estos cromosomas consiste en una cadena individual de ADN que se ha condensado. Pues a cada uno de los extremos de cada cadena se le denomina telómero. Los telómeros consisten en un número variable de repeticiones de una secuencia corta. Esta secuencia es TTAGGG en vertebrados. El número de repeticiones de esta secuencia varía con la especie, siendo de alrededor de 2500 en humanos. Estos telómeros, con cada división celular, se irían acortando, al eliminarse los cebadores de la duplicación del ADN. Para evitar este acortamiento, la célula expresa la telomerasa: es la encargada de restablecer la longitud de los telómeros.

Subunidad catalítica de la TERT de Tribolium castaneum, el falso gorgojo de la harina. Es la única de la que disponemos estructura tridimensional, pero comparte un 80% de identidad con la TERT de humanos.

Normalmente, esta telomerasa permanece inactiva en las células postnatales, excepto en aquellas que pueden dividirse normalmente, como las células germinales (las precursoras de los gametos), las de la capa germinal de la piel o las del sistema inmunitario. Se piensa que la desregulación de esta proteína tiene que ver con la aparición de tumores.

Funcionamiento de la hTERT

Al contrario que la RT, la hTERT no necesita ningún cebador para funcionar porque la propia enzima lleva incorporado su propio cebador, al que se denomina TERC o telomerase RNA component. Este componente no es más que un ARN con la secuencia CAAUCCCAAUC y que forma parte del complejo telomerasa. Este ARN se unirá a la secuencia TTAGGG del telómero y copiará en forma de ADN el extremo cromosómico que va retrasado, añadiendo las repeticiones que sean necesarias para que el telómero no pierda su longitud. Antes de unirse definitivamente, el dominio TBD de la hTERT formará una superestructura llamada G-quadruplex que sólo puede formarse en los telómeros que han de repararse. Si esta estructura no se forma y la región TBD no la reconoce, no habrá extensión telomérica.

Paso 1: La hTERT localiza el telómero sin terminar, buscando el extremo del cromosoma, gracias a su conformación espacial, que se ajusta a la conformación espacial del G-quadruplex del telómero.

Paso 2: La hTERT hace coincidir el fragmento de ARN que contiene (TERC) con la secuencia telomérica incompleta, mediante complementariedad de la secuencia de TERC con la secuencia del telómero libre.

Paso 3: La hTERT une nucleótidos de ADN al TERC, también mediante complementariedad de la secuencia, de forma que se extiende la repetición telomérica TTAGGG.

Paso 4: La hTERT se mueve hasta el siguiente sitio donde unirá el TERC, también por complementariedad, para unir otra repetición más.

Paso 5: Cuando ha terminado de añadir repeticiones, la hTERT sale del telómero y deja paso a la ADN-polimerasa, que se unirá a la cadena libre que queda y copiará la cadena que falta dejando el cromosoma completo.

Diferencias RT-hTERT


Como podéis ver, no es sólo que las dos proteínas sean completamente diferentes, sino que además funcionan de forma totalmente distinta.

Dominio thumb de la RT de HIV-1 (arriba) y de TERT (abajo).
Las flechas señalan la región estructuralmente similar y expuesta.
Para empezar, el modo de actuación no es el mismo. Mientras que la RT del VIH funciona como un heterodímero entre la actividad polimerasa y la subunidad catalítica propiamente dicha, la hTERT funciona como un homodímero de dos hTERT completas. La RT del VIH funciona como un complejo entre la proteína p66 y la proteína p51 del virus. La actividad RT reside en la subunidad p66, mientras que la p51 posee una actividad polimerasa que permanece inactiva hasta que se necesita. Estructuralmente, la RT posee 4 dominios que permiten la entrada del ARN del virus y la operación de la propia enzima. El dominio denominado "palm" es el que contiene la actividad catalítica de la enzima y es el que distingue las subunidades p66 y p51 entre sí. En el caso de la hTERT, la estructura final la componen dos unidades iguales de la misma proteína, formando un anillo por el que podrá pasar el ADN y hacer funcionar el TERC como cebador para la copia de las repeticiones del telómero. El único punto en que RT y hTERT parecen coincidir es en la organización de los dominios denominados "thumb" de ambas proteínas, que adoptan una conformación espacial muy similar en ambas proteínas. En concreto, es una de las α-hélices de ambas proteínas las que poseen una secuencia muy similar. Sin embargo, las regiones inmunogénicas, esto es, capaces de generar una respuesta inmune en el paciente, no se encuentran dentro del dominio thumb, sino en otras regiones distintas.

No obstante, cuando intentamos alinear las secuencias de ambas, mediante distintos métodos de alineación de secuencias (BLAST, COBALT, CLUSTAL) no encontramos más allá de un 24% de identidad de secuencia entre una y otra proteína.

¿Por qué os cuento todo esto? Pues porque cuando se intenta detectar la retrotranscriptasa en un análisis para determinar la presencia del VIH, se utilizan anticuerpos frente a ella. En el siguiente capítulo hablaremos largo y tendido sobre anticuerpos (a los que también dedicaré un artículo entero). Ahora baste decir que sin una combinación concreta entre superficies proteicas y secuencia de aminoácidos, los anticuerpos no van a reconocer esa proteína en concreto. Así pues, cuando buscamos RT del VIH con anticuerpos no vamos a detectar hTERT. En primer lugar porque los epítopos de la hTERT no poseen identidad de secuencia suficiente como para interactuar de manera correcta con anticuerpos frente a RT. Y en segundo lugar, porque las superficies expuestas de ambos epítopos no van a coincidir.

Añadiré a esto que detectar la actividad retrotranscriptasa del VIH y distinguirla de aquella de la hTERT no puede ser más sencillo: la RT del VIH tiene como diana moléculas de ARN y sólo se va a unir a moléculas de ARN a las que se ha unido el ARNt que utiliza como cebador. La hTERT ya lleva su propio ARN para funcionar y su diana son moléculas de ADN con una secuencia concreta y reconoce antes un tetrámero de ADN (G-quadruplex) para unirse a ella y funcionar. Por lo que confundir una actividad con otra viene siendo virtualmente imposible.

Por todo lo dicho, vista su secuencia, su superficie y comparada la RT con la hTERT, no sólo en estructura y secuencia, sino también en función, podemos decir que es bastante improbable confundir una con otra.

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