lunes, 4 de abril de 2016

¿Existe el VIH? (VI): Diagnóstico por Western Blot.

Equipamiento básico para Western Blot. Fuente:
http://brc.boisestate.edu/dna-and-protein-isolation-and-characterization/
En nuestro último capítulo sobre el monográfico sobre el VIH, describíamos la técnica del ELISA y cómo nos servía para determinar la presencia tanto de las proteínas propias del VIH como de los anticuerpos frente a las mismas. Sin embargo, el ELISA no puede ser un diagnóstico definitivo por los problemas que comentábamos allí sobre reactividad cruzada que algunas proteínas provenientes del VIH presentaban con proteínas de hongos (Candida sp.), bacterias (Borrelia burgdorferi o Treponema pallidum) y otros virus (gripe).

Hoy vamos a internarnos en el Western Blot, otro método de inmunodetección, algo menos específico que el ELISA, pero que, juntos, nos pueden determinar la presencia de anticuerpos del paciente frente al VIH o de las proteínas propias del virus.



Western Blot: describiendo la técnica.

La técnica original de Western Blot la describió Harry Towbin en 1979. Una curiosidad sobre el nombre es que resulta de un juego de palabras con respecto a la técnica desarrollada por Edwin Southern para detectar secuencias de ADN (el Southern blot). La técnica para detectar la molécula que falta, el ARN, se llama Northern blot y fue desarrollada por George Stark, que también jugó con el nombre.

La técnica de Western Blot aprovecha la electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE), que se utiliza para separar proteínas por su peso molecular, para detectar proteínas concretas utilizando anticuerpos específicos frente a ellas. Separarlas por su peso molecular no sirve para identificarlas, porque hay proteínas muy distintas con pesos moleculares muy similares que formarán una única banda (que dependerá del porcentaje de acrilamida), pero no se podrán distinguir a menos que exista algo que nos distinga una proteína de otra.

SDS-PAGE: separando las proteínas

En una muestra dada hay un batiburrillo de proteínas que pueden estar asociadas entre sí, intentando huir de la interacción hidrofílica por su alto contenido hidrofóbico, plegadas, formando complejos... En esta especie de sopa hay que distinguir una única proteína. Una sola. Así que lo primero que hay que hacer es separarlas de forma que podamos distinguirlas. 

Esquema de la separación de proteínas mediante SDS-PAGE
Para ello, lo primero es deshacer las interacciones entre ellas y solubilizar correctamente las proteínas, que se disuelven en una solución desnaturalizante con SDS, un tensioactivo que ayuda a deshacer las interacciones moleculares. Estas muestras se calientan a 100 ºC para deshacer el plegamiento tridimensional de las proteínas, de forma que estén completamente extendidas y puedan separarse por su peso molecular. El plegamiento y asociación de las proteínas cambia el volumen que ocupan las proteínas y, por lo tanto, alterará su avance en el gel de poliacrilamida. Al desplegarlas y mantenerlas sin estructura tridimensional, la proteína avanzará hasta allí donde pueda, según su tamaño.

Una vez que se han desnaturalizado, se inyectan las muestras en el gel de poliacrilamida. Este gel consiste en un polímero de acrilamida + bisacrilamida que formará una red tridimensional porosa por la que avanzarán las proteínas. El gel se divide en dos partes: un gel concentrador, de menor porcentaje de acrilamida + bisacrilamida, y un gel separador que tiene un porcentaje mayor. Esto permite que, al avanzar la muestra en el gel, se "junte" toda en la parte superior del gel separador. De esta forma, todas las proteínas pueden entrar a la vez en éste, formando un frente que nos permitirá ver, gracias a un colorante químico, por dónde va avanzando nuestra muestra. Esto nos ayudará a evitar que se nos salga y perdamos algo de interés. El porcentaje de acrilamida + bisacrilamida determinará cómo se van a separar las proteínas: a mayor porcentaje, más pequeño será el poro de la red tridimensional del gel y se separarán proteínas más pequeñas, quedando las mayores sin separar e incluso sin entrar en el gel. Cuanto menor sea el porcentaje, mejor se separarán las proteínas de mayor tamaño molecular, escapándose del gel las proteínas más pequeñas. Al gel se añadirá un patrón de proteínas con tamaño molecular conocido para poder reconocer y estimar el tamaño molecular de la proteína que vayamos a detectar.

Las proteínas se hacen avanzar en el gel mediante la aplicación de corriente eléctrica. Gracias a la adición de SDS y β-mercaptoetanol a la preparación de la muestra, la carga neta de las proteínas será negativa. Así, el gel se somete a una diferencia de potencial entre el extremo por el que se cargan las proteínas y el extremo contrario. De este modo, las proteínas, con carga negativa, irán avanzando hacia el polo positivo hasta que la red de poliacrilamida no las deje avanzar debido a su tamaño.

Detección: uso de anticuerpos.

Una vez que hemos separado las proteínas por su tamaño molecular, es hora de detectarlas. Pero la red de poliacrilamida impide la entrada de los anticuerpos al gel, así que lo que habrá que hacer es sacar las proteínas del gel. Para ello, y aprovechando que las proteínas siguen con carga neta negativa, vamos a aplicar una corriente perpendicular al gel para pegar las proteínas a una membrana sintética. Esta membrana está hecha de PVDF o de nitrocelulosa y permite la adherencia de las proteínas con bastante facilidad. Es por ello que hay que trabajar con mucho cuidado y pulcritud, evitando que se peguen a la membrana proteínas que no estuvieran ya en ella.

Esquema del proceso de transferencia y detección de la proteína
En esa membrana, si la teñimos con una solución colorante a base de rojo Ponceau, veremos los carriles por los que han ido avanzando las proteínas y una serie de bandas, tanto más notables cuanto mayor sea la cantidad de proteína presente en esa banda. La amplitud de la banda indica que hay proteínas de un peso molecular muy próximas que no se han separado del todo.

El rojo Ponceau se lava fácilmente y la membrana queda expuesta, a excepción de las moléculas de proteína que quedan sobre ella. Así que para evitar que cualquier otra proteína que entre en contacto con ella se pegue a la misma y nos altere el resultado, se añade un bloqueante. Normalmente, se hace añadiendo una solución de albúmina sérica bovina o leche en polvo, que no tendrán proteínas que nos interfieran en la unión del anticuerpo, pero que sí se pegarán a la membrana en los sitios que no nos interesa que se pegue nada más.. Recodad: también son proteínas y podrían pegarse en la membrana, produciéndonos señales inespecíficas.

Es la hora de localizar la proteína. Nosotros escogeremos cualquiera del VIH, como por ejemplo la proteína gag. ¿Os acordáis de nuestro artículo sobre los anticuerpos? Si no es así, pasaos por él y descubriréis que los anticuerpos sólo reaccionan ante el epítopo al que van dirigidos y sólo se pegarán a él. Esta especificidad aumenta cuando el anticuerpo es monoclonal. ¿Qué quiere decir esto? Que proviene del mismo clon, esto es, que el anticuerpo proviene del mismo linfocito B. Así, todas las moléculas, sin excepción, van a reaccionar frente al mismo epítopo de nuestra proteína y sólo nuestra proteína. Este anticuerpo, dentro del contexto de la técnica, se denomina anticuerpo primario y es homólogo al anticuerpo de detección que se utiliza en el ELISA.

Pero esto nos deja con un problema: a cada molécula de proteína de interés sólo se le podría unir un anticuerpo. Y detectarla seguiría siendo difícil. Para evitar esto, lo que hacemos es volver a bloquear la membrana y añadir un anticuerpo secundario que, diferencia del anterior, será policlonal. ¿Qué conseguimos con esto? Fácil: que a cada anticuerpo primario se le podrán unir varios anticuerpos secundarios. Al ser policlonal, cada molécula de anticuerpo secundario se unirá a un epítopo del anticuerpo primario.

Representación de una placa revelada de Western Blot. Las
flechas señalan los carriles en los que se ha detectado la
proteína que buscábamos. Las X señalan los carriles en los
que la proteína de interés no estaba presente.
Cada molécula de anticuerpo secundario lleva conjugada un "chivato" que servirá para "ver" la proteína. Bien puede ser un isótopo radiactivo, bien una proteína fluorescente o bien una proteína que produzca fluorescencia. El primero tiene la pega de que es bastante sucio y da manchas muy inespecíficas. El segundo, tiene el problema de que las moléculas fluorescentes pueden ser demasiado grandes y alterar la unión entre primario y secundario. El tercero es el más utilizado. Actualmente, los anticuerpos secundarios se conjugan con peroxidasa de rábano que, al ponerla en contacto con agua oxigenada y una molécula quimioluminiscente, emite luz. Esa luz se aprovecha para poner una placa fotográfica sobre la membrana que, en la parte que le dé la luz, se velará. Así, dejará una mancha exacta en la placa allí donde está la proteína.


Problemas del Western Blot


Ejemplo de Western Blot inespecífico. Las flechas señalan
las diferentes bandas detectadas.
Los problemas que presenta esta técnica son principalmente dos: la inespecificidad y la reactividad cruzada. El primero de ellos nos lleva a detectar proteínas que unen el anticuerpo sin tener por qué o bien porque unen el anticuerpo secundario sin haber primario. El aspecto que tiene un Western Blot que sufre problemas de inespecificidad es el que tenéis aquí a la izquierda. 

Vamos al caso que nos ocupa, que es el del VIH. En este caso, lo que se detecta en el análisis son los anticuerpos frente al VIH. Se corre un gel con una muestra de sangre y después se detecta con un anticuerpo primario monoclonal frente a los anticuerpos del paciente. Si el epítopo está en la región Fc del anticuerpo del paciente, obtendremos un patrón similar al de la imagen anterior, puesto que ese anticuerpo monoclonal detectará, casi con toda seguridad otros anticuerpos que hubiera en la muestra del paciente. El anticuerpo primario, por lo tanto, deberá estar dirigido frente al Fab del anticuerpo del paciente. Además, este anticuerpo debe ser de especie distinta al ser humano, para evitar aún más especificidad (normalmente son de ratón). El anticuerpo secundario, para evitar más problemas, deberá ser de una tercera especie (cabra, conejo o rata son los más habituales) y estarán dirigidos frente al primario. Si se escogen anticuerpos monoclonales se puede reducir al máximo la inespecificidad y conseguiremos un Western Blot muy limpio.

El problema de la reactividad cruzada tiene peor solución. Si volvéis a echar un ojo al artículo de los anticuerpos, comprobaréis cómo ésta se produce cuando hay epítopos que son muy similares en proteínas muy diferentes (lo que llamábamos mimotopos). Si seguís leyendo, encontraréis que algunos hongos, como Candida han conseguido que alguna de sus proteínas imiten a las del VIH, escapando del control del sistema inmunitario. También comparte algunos epítopos con proteínas de Borrelia burgdorferi o del virus de la gripe.

Sin embargo, existe una forma de distinguir entre unos epítopos y otros que es muy sencilla. ¿Os acordáis de que al principio de la técnica hemos añadido un marcador de peso molecular? Pues nos va a servir para saber qué peso molecular tiene el antígeno que estamos detectando. Si el peso molecular no coincide con el de la proteína del VIH o el anticuerpo frente a la misma que estemos buscando, no se podrá atribuir al VIH por mucho que el anticuerpo se le una. Por esto, a pesar de la especificidad que presentaba el ELISA, es necesaria la confirmación por Western Blot, evitando falsos positivos entre una y otra técnica.

Además de esto, se están desarrollando nuevos test de Western Blot. En los que se llaman ensayos de cuarta generación, la proteína diana de preferencia es la p24 o CA (de la cápside), que, hasta el momento, no tiene reactividad cruzada conocida ninguna. Además, estos tests tienen una ventaja añadida: se puede detectar la proteína en sangre tan solo dos semanas después de la infección.

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